Identificación de genes de virulencia en cepas de Escherichia Coli aisladas de dos líneas genéticas de aves de postura ligeras

Resumen En el presente trabajo se identificaron seis genes de virulencia asociados con Escherichia coli patógenas (APEC), en 66 cepas aisladas a partir del bazo, hígado, médula ósea y saco vitelino de pollitas de reemplazo ligeras de 10 días de edad pertenecientes a dos líneas genéticas. Los genes, identificados mediante la técnica de PCR, fueron […]

Resumen

En el presente trabajo se identificaron seis genes de virulencia asociados con Escherichia coli patógenas (APEC), en 66 cepas aisladas a partir del bazo, hígado, médula ósea y saco vitelino de pollitas de reemplazo ligeras de 10 días de edad pertenecientes a dos líneas genéticas. Los genes, identificados mediante la técnica de PCR, fueron iroN, iss, hlyF, iutA, ompT y tsh. Si una cepa presenta tres o más de los genes anteriormente mencionados se considera como virulenta. El 67% de las cepas estudiadas fueron clasificadas como virulentas y la gran mayoría de éstas presentaron los genes hlyF, iutA y ompT. Muchas de las cepas virulentas muestran patrones de distribución de genes similares dentro de cada línea genética de ave, pero diferentes entre ellas, y se pueden englobar en tres o cuatro conjuntos. Lo anterior sugiere la predominancia de ciertos grupos de E. coli con características y factores de virulencia similares capaces de causar enfermedad en las líneas genéticas estudiadas; y que puede ser clave para desarrollar un método de prevención específico para la zona geográfica y la estirpe de las aves. La prevalencia de los genes de virulencia en las cepas de este trabajo difiere con la observada en otras investigaciones alrededor del mundo, lo cual puede indicar que las cepas APEC de México utilizan mecanismos de virulencia diferentes a los observados comúnmente.

Introducción

La colibacilosis es la enfermedad bacteriana más común de las aves domésticas y colectivamente, las infecciones por E. coli en sus diversas presentaciones provocan grandes pérdidas económicas (1). E. coli es el principal microorganismo de la microbiota intestinal de las aves, además de que se aísla comúnmente del tracto respiratorio superior y está presente en la piel y las plumas (2). A pesar de que E. coli es un habitante normal del tracto digestivo, existen algunas cepas capaces de establecer infecciones en otras partes del organismo dada su capacidad de sobrevivir fuera del intestino. Estas cepas se clasifican dentro de una categoría denominada E. coli patógena extraintestinal (ExPEC), la cual se compone por los patotipos E. coli uropatogénica (UPEC), E. coli causante de meningitis neonatal (NMEC) y E. coli patógena aviar (APEC). Los primeros dos patotipos producen enfermedad en humanos y el último en aves. Aún con la diferencia de hospedadores, estas cepas están estrechamente relacionadas y comparten muchas propiedades de virulencia (3).

Las cepas APEC son capaces de establecer una gran variedad de infecciones extraintestinales, las cuales afectan a todos los tipos de aves de producción, incluyendo pollos de engorda, gallinas de postura y reproductoras (1). Durante mucho tiempo la colibacilosis se consideró una infección secundaria a una enfermedad respiratoria o a condiciones ambientales desfavorables, sin embargo, cada vez existe una mayor evidencia de que las cepas APEC cuentan con todos los mecanismos necesarios para ser considerados patógenos primarios (4).

Dado que E. coli es un habitante normal del tracto digestivo de las aves, es difícil determinar si un aislamiento pertenece a una cepa comensal o a una patógena. Esto ha despertado el interés de muchos investigadores que han tratado de identificar características específicas de las cepas APEC para poder diferenciarlas de las comensales; concluyendo que algunas características como la producción de colicina V (ColV), expresión de fimbria tipo F1, letalidad embrionaria y la pertenencia a ciertos serogrupos como O1, O2 y O78 se observan con mucha más frecuencia en las cepas patógenas (1,5,6). Esto demuestra que las cepas APEC han adquirido genes de virulencia agrupados en islas de patogenicidad (PAI’s), localizados en cromosomas o plásmidos. La presencia de estas PAI´s es considerada una característica definitoria de las cepas APEC y ha sido utilizada como un efectivo método de diagnóstico (7). Algunos de los genes más comunes dentro de las PAI´s son iroN, iss, hlyF, iutA, ompT y tsh, los cuales se localizan en el plásmido ColV (1,7).

El objetivo de este trabajo fue la identificación de seis genes de virulencia que han sido estrechamente relacionados con el patotipo APEC (iutA, hlyF, iss, iroN, ompT y tsh) en cepas de E. coli aisladas de dos líneas genéticas (A y B) de gallinas de postura ligeras de una empresa productora de huevo en el estado de Jalisco. Por mucho tiempo, en esta empresa se ha utilizado una de ellas; sin embargo, por la alta incidencia de colibacilosis se decidió introducir una parvada de otra línea genética para poder comparar su comportamiento ante esta enfermedad. La información obtenida permitirá establecer las bases para poder decidir qué línea genética es más conveniente utilizar y para plantear nuevas estrategias para la prevención y control de esta enfermedad. Además, los resultados ayudarán a tener más información acerca de la colibacilosis en México debido a que se identificarán genes de virulencia que no se han buscado previamente en el país.

Material y Métodos

Cepas bacterianas. Se utilizaron sesenta y seis cepas de E. coli conservadas en medio Dorset. Estas cepas fueron aisladas de pollitas de reposición de dos líneas genéticas; 40 de ellas se aislaron de la línea A y las 26 restantes de la línea B. Las cepas se aislaron a partir de distintos órganos como saco vitelino, médula ósea, hígado y bazo.

Detección de genes de virulencia. Se utilizó una prueba de PCR de acuerdo al protocolo de López Saucedo et al. (8) para identificar cada uno de los genes de virulencia. Las condiciones fueron las siguientes: 1mM Tris-HCl-KCl, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP´s, 0.5 U Taq DNA Polimerasa (Invitrogen), 1.4 µM de cada iniciador, 13.9 µL de agua destilada y 2 µL de templado. La reacción se llevó a cabo utilizando un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) utilizando los siguientes parámetros: 95°C por 13 min; 32 ciclos de 94°C por 30 s, 63°C por 30 s, 68°C por 3 min; y una extensión final de 72°C por 10 min.

Determinación de cepas virulentas. De acuerdo con el trabajo de Johnson et al. (7), una cepa se consideró virulenta si presentaba tres o más genes de virulencia.

Resultados

En la Figura 1 se muestra la prevalencia de los genes de virulencia en las cepas de Escherichia coli totales y en las virulentas; así como la de ambas líneas genéticas. En ella se puede observar que el gen que se presentó con mayor frecuencia en el total de las cepas fue iutA, el cual se encontró en el 72.7% (n=48); mientras que el gen tsh fue el que tuvo una menor prevalencia con solo un 15.2% (n=10). Entre las cepas virulentas, el gen hlyF tuvo una prevalencia del 100% (n=44) y en todas ellas, a excepción de dos, estuvo asociado con los genes iutA y ompT. Además, los genes hlyF y ompT no se encontraron en ninguna de las cepas no virulentas. A pesar de que el gen tsh tuvo la menor prevalencia, éste solo se encontró en cepas virulentas y 9 de las 10 cepas en las que se identificó, presentaron los seis genes de virulencia.

La combinación de genes más común fue la que involucró al gen hlyF con los genes iutA y ompT. Esta combinación se presentó en 42 de las 66 cepas (63.6%) y todas ellas fueron virulentas. Dentro de estas 42 cepas, el 45.2% (n=19/42) presentaron esta asociación sin ningún otro gen presente. La mayoría de éstas fueron aisladas de la línea A, principalmente de saco vitelino y médula ósea.

El número de genes de virulencia presentes en las cepas de Escherichia coli estudiadas y sus combinaciones se muestran en el Cuadro 1. En éste, se asignó un número de patrón determinado a cada una de las combinaciones, los cuales van desde P1 hasta P14. Se puede observar que, de las 66 cepas analizadas, el 15% (n=10) no presentó ninguno de los genes de virulencia; mientras que el 14% (n=9) de las cepas presentaron los seis genes. Por otro lado, el patrón que se encontró con mayor frecuencia fue el P7 (n=19, 29%), que incluye a las cepas que presentaron los genes hlyF, iutA y ompT.

Al comparar los aislamientos de cada una de las líneas genéticas, se observó que el 62% (n= 25/40) de las cepas de la línea A fueron virulentas, comparado con el 73% (n=19/26) de cepas virulentas de la línea B. De las 19 cepas que se encuentran dentro del patrón P7, el 74% (n=14/19) fueron aisladas de la línea A, mientras que en el patrón P1, de las 9 cepas de este grupo, el 89% (n=8/9) pertenecen a la línea genética B.

Discusión

La prevalencia de los genes de virulencia encontrada en el presente estudio difiere significativamente de la observada en investigaciones relacionadas. Esto puede ser un indicio de que los mecanismos de virulencia de las cepas APEC aisladas en México son diferentes a los presentados por otros autores. No obstante, de acuerdo con Wang et al. (9), lo anterior se puede deber a diversas razones como la zona geográfica, el tipo y la edad de las aves de las cuales se realizan los aislamientos y de la presentación de la enfermedad. Por lo tanto, es necesario realizar más estudios al respecto para identificar una mayor cantidad de genes de virulencia en aislamientos obtenidos en distintas regiones geográficas y de diferentes tipos de aves para poder reconocer mejor las similitudes y diferencias en el genotipo de las cepas APEC mexicanas, y así clarificar los mecanismos de virulencia utilizados por éstas.

Al analizar la prevalencia de los genes dentro de las cepas virulentas y compararlos entre ambas líneas genéticas se encontró que los genes hlyF, iutA y ompT son altamente importantes para la virulencia de las cepas APEC de este estudio sin importar el hospedador, mientras que los genes restantes (iroN, iss y tsh) no fueron vitales. Lo anterior difiere de investigaciones previas en las que los genes iroN, iss y tsh se encontraron con alta frecuencia en E. coli patógenas. Sin embargo, se han identificado genes con funciones similares a los mencionados anteriormente, los cuales podrían actuar como suplentes y así, otorgar a la bacteria los mecanismos necesarios para causar enfermedad (1,7).

Debido a que esta enfermedad provoca grandes pérdidas económicas en la empresa, es necesario identificar la fuente de infección de las aves y ejecutar acciones para reducir este impacto en la producción. Según Ghunaim et al. las medidas indirectas de protección, como el control de agentes virales y micoplasmosis, así como la reducción de los niveles de amoniaco en las casetas son insuficientes para un control efectivo de la enfermedad; por lo tanto, la vacunación es una opción efectiva para la prevención (10). La demostración de la alta frecuencia con la que se encontraron ciertas combinaciones de genes dentro de las cepas virulentas del presente trabajo demuestra la importancia de serotipificarlas y, así, descubrir si existe un patrón de genes característico para cada uno de los serotipos encontrados. Una vez obtenidos estos resultados, se contará con información suficiente para comenzar el desarrollo de una vacuna inactivada contra los serotipos predominantes, o de subunidades, en la cual se incluyan las proteínas codificadas por los genes con mayor prevalencia. Existen algunos estudios en los que se han probado este tipo de vacunas experimentales con resultados exitosos (11,12). De igual manera, sería ideal realizar un trabajo similar en el que se involucre a un mayor número de empresas de esa zona, para así obtener resultados más generales y lograr establecer medidas de control que beneficien a toda la región.

Anexos

Referencias

1. Nolan LK, Barnes JH, Vaillancourt J-P, Abdul-Aziz T, Logue CM. Colibacillosis. In: Diseases of Poultry. 13th Editi. 2013. p. 751–805.
2. Lutful Kabir SM. Avian colibacillosis and salmonellosis: A closer look at epidemiology, pathogenesis, diagnosis, control and public health concerns. Int J Environ Res Public Health. 2010;7(1):89–114.
3. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HLT. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol. 2004;2(2):123–40.
4. Vandekerchove D, De Herdt P, Laevens H, Pasmans F. Colibacillosis in caged layer hens: Characteristics of the disease and the aetiological agent. Avian Pathol. 2004;33(2):117–25.
5. Gibbs PS, Maurer JJ, Nolan LK, Wooley RE. Prediction of chicken embryo lethality with the avian Escherichia coli traits complement resistance, colicin V production, and presence of the increased serum survival gene cluster (iss). Avian Dis. 2003;47(2):370–9.
6. Rosario CC, López a CC, Téllez IG, Navarro O a, Anderson RC, Eslava CC. Serotyping and virulence genes detection in Escherichia coli isolated from fertile and infertile eggs, dead-in-shell embryos, and chickens with yolk sac infection. Avian Dis [Internet]. 2004;48(4):791–802. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15666860
7. Someya A, Otsuki K, Murase T. Characterization of Escherichia coli strains obtained from layer chickens affected with colibacillosis in a commercial egg-producing farm. J Vet Med Sci. 2007;69(10):1009–14.
8. Johnson TJ, Wannemuehler Y, Doetkott C, Johnson SJ, Rosenberger SC, Nolan LK. Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool. J Clin Microbiol. 2008;46(12):3987–96.
9. Dissanayake DRA, Octavia S, Lan R. Population structure and virulence content of avian pathogenic Escherichia coli isolated from outbreaks in sri lanka. Vet Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;168(2–4):403–12. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.11.028
10. Fairbrother JM, Dozois CM, Dho-moulin M, Bre A, Desautels C, Iii ROYC. Relationship between the Tsh Autotransporter and Pathogenicity of Avian Escherichia coli and Localization and Analysis of the tsh Genetic Region. Infect Immun. 2000;68(7):4145–54.
11. Johnson TJ, Wannemuehler YM, Nolan LK. Evolution of the iss gene in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2008;74(8):2360–9.
12. Lopez-Saucedo C, Cerna JF, Villegas-Sepulveda N, Thompson R, Velazquez FR, Torres J, et al. Single multiplex polymerase chain reaction to detect diverse loci associated with diarrheagenic Escherichia coli. Vol. 9, Emerging infectious diseases. 2003. p. 127–31.
13. Rodriguez-Siek KE, Giddings CW, Doetkott C, Johnson TJ, Nolan LK. Characterizing the APEC pathotype. Vet Res [Internet]. 2005;36(2):241–56. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15720976
14. Wang Y, Tang C, Yu X, Xia M, Yue H. Distribution of serotypes and virulence-associated genes in pathogenic Escherichia coli isolated from ducks. Avian Pathol. 2010;39(4):297–302.
15. Ghunaim H, Abu-Madi MA, Kariyawasam S. Advances in vaccination against avian pathogenic Escherichia coli respiratory disease: Potentials and limitations. Vol. 172, Veterinary Microbiology. 2014.