Actualización en el diagnóstico laboratorial de Pasteurella multocida y Streptococcus suis

Dos importantes patógenos que participan en el desarrollo del síndrome respiratorio porcino.

La interpretación correcta de los resultados en el diagnóstico de la enfermedad respiratoria en el ganado porcino depende de los conocimientos que se tengan sobre epidemiología y de los detalles que se conozcan de la situación concreta de la explotación afectada.

Ivette Espinosa CastañoLaboratorio de Bacteriología Animal
Dirección de Salud Animal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

Pasteurella multocida y Streptococcus suis son importantes patógenos que participan en el complejo respiratorio porcino (CRP), denominación dada a los cambios y lesiones que producen una disminución en la actividad respiratoria de los animales afectados. Se denomina complejo porque es una manifestación de etiología multifactorial con interacciones microbianas (Van der Sluijs y col., 2010). Los efectos del CRP son notables debido a la disminución en la conversión alimentaria y en los costes en medicación (Pijoan y col., 1999; Higgins y col., 2005).

P. multocida causa un amplio rango de presentaciones en varios hospedadores, y en el cerdo puede dar lugar a dos condiciones clínicas: la rinitis atrófica progresiva (RAP) y la pasteurelosis neumónica. S. suis también produce lesiones en el tracto respiratorio, pero las cepas muy virulentas dan lugar a meningitis y endocarditis. Además, S. suis puede infectar al personal con riesgo ocupacional y producir cuadros clínicos similares. En países de Asia existe un riesgo mayor debido a la crianza traspatio y al consumo de sangre derivada de los animales portadores (Vu Thi Lan Huong y col., 2014; Goyette-Desjardins y col., 2014; Bonifait y col., 2014).

En cualquier lugar del mundo en el que se explota intensivamente el porcino se produce, en mayor o menor grado, la enfermedad respiratoria, aunque existen variaciones regionales en relación con la presencia de patógenos respiratorios específicos, condiciones climáticas y tipos de alojamiento. El diagnóstico es uno de los aspectos prioritarios y se apoya en diferentes ensayos organizados en un algoritmo según las capacidades de los laboratorios. La correcta interpretación de los resultados depende de conocimientos sobre epidemiología y detalles sobre la situación concreta de la explotación afectada.

En la actualidad, existen diferentes métodos de laboratorio que permiten detectar con rapidez y especificidad el microorganismo patógeno a partir de cultivos o de muestras directas, y a su vez permiten abordar la diversidad bacteriana. El propósito de esta revisión es la actualización de las tendencias que rigen el diagnóstico y la tipificación de P. multocida y S. suis, dos bacterias de gran interés en el CRP.

Identificación y tipificación de P. multocida y S. suis

Cada una de estas dos especies comprende diferentes serogrupos y dentro de estos existe una población con cepas que presentan notables diferencias en cuanto a la virulencia (Subaaharan y col., 2010; Feng y col., 2014). Ambas bacterias pueden aislarse de animales asintomáticos (Bethe y col., 2009; Su y col., 2008). Por ello, son precisas herramientas de detección con un alto poder discriminatorio y se utilizan tres tipos de aproximaciones experimentales: los métodos microbiológicos, los ensayos moleculares y las pruebas inmunológicas (Rimler y col., 1989; Boot y col., 2004).

La presencia de colonias lisas, brillantes, de aspecto grisáceo y traslúcido, de aproximadamente 1 mm de diámetro, después de 24 horas en agar Columbia suplementado con sangre de carnero son típicas del géneroPasteurella, la ausencia de crecimiento en agar Mac Conkey y la prueba oxidasa positiva permiten discriminar de otros géneros con características culturales similares. Mediante las pruebas bioquímicas es posible corroborar que se trata de P. multocida (Bethe y col., 2004; Boot y col., 2004; Dziva y col., 2008 ).

El género Streptococcus se identifica fácilmente a partir de sus características culturales, colonias pequeñas, la tinción de Gram revela células cocoides en pareja o en cadenas corta y la prueba de la catalasa es negativa. A continuación es preciso conocer de qué especie del género se trata, para lo cual es posible realizar pruebas bioquímicas. Aunque en ocasiones la identificación bioquímica es muy difícil debido a la presencia de otras especies de Streptococcus que son parte de la microbiota normal y son fenotípicamente similares a S. suis(Berthelot-hérault y col., 2000).

Los ensayos moleculares basados en la PCR son una alternativa para confirmar con rapidez y especificidad de qué especie se trata. Estos ensayos se utilizan en dos vías para la detección y para el análisis orientados a la tipificación (Barenfanger y col., 1999; Kerremans y col., 2008; Järvinen y col., 2009; Cai y col., 2014). Resulta factible realizar esta prueba a partir de la propia colonia del cultivo, de la siembra primaria de apenas 24 horas de incubación o, más rápido, a partir de un exudado tomado directamente de la muestra, sin cultivar.

Las dianas en el genoma bacteriano seleccionadas para la amplificación por PCR deben conservarse para confirmar de qué especie se trata, lo que garantiza su presencia en todas las cepas a encontrar. La selección de la diana es muy controvertida para S. suis. Okavvwuma y col. (2003) describieron una pareja de cebadores: la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH). Marois y col. (2007) reportaron otros cebadores para un fragmento del ácido ribonucleico ribosómico 16S (ARNr16s) de S. suis. Existen trabajos publicados que plantean que los cebadores para GDH son menos específicos que los del ARNr16S, por ejemplo Streptococcus gallolyticus se identificó erróneamente como S. suis utilizando esta diana (Le HTT y col., 2013).

Aunque S. suis puede cultivarse apropiadamente en los medios utilizados en los laboratorios veterinarios, cuando produce meningitis en humanos, en los laboratorios de medicina humana, se ha identificado erróneamente como un enterococo (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus bovis), con un Streptococcus viridans (Streptococcusanginosus y Streptococcus vestibularis) o incluso como Listeria monocytogenes, de ahí la importancia de las técnicas moleculares y su implementación en ambos laboratorios (Tien, 200).

En 1998, Townsend y col. publicaron la secuencia de una pareja de cebadores para P. multocida que ha sido utilizada hasta la fecha exitosamente para corroborar su identificación. La PCR es rápida, sensible y específica, pero debe estar apoyada por un riguroso sistema de buenas prácticas que evite las contaminaciones entre los locales donde se prepara la mezcla de reactivos y aquellos donde se añade el ADN y se revela el resultado, principal desventaja de esta metodología, que puede dar resultados falsos positivos.

S. suis produce una cápsula polisacarídica en su superficie, según su composición química se describieron 35 serotipos (Gottschalk y col., 1993). En la actualidad se reconocen 33 (1- 31, ½ y 33) (Liu y col., 2013), pues los serotipos 32 y 34 se reclasificaron como Streptococcus orisratti (Hill y col., 2013). Aunque aún no se esclarece la relación serotipo y una condición patológica dada, las cepas aisladas de animales enfermos pertenecen en orden decreciente a los serotipos 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 1/2 en países de Asia (Kim y col., 2010), en Europa los serotipos 9, 1 y 14 (Wiselink y col., 2010) y en Canadá los serotipos 2, 3, 4, 7 y 8 (Messier y col., 2008). Existen dos laboratorios de reconocido prestigio en Dinamarca y Canadá que basan la tipificación de S. suis mediante la técnica de coaglutinación con el uso de antisueros obtenidos a partir de cepas de referencia (Gottschalk y col.,1993).

Se han valorado otras opciones para determinar los serotipos: la genoserotipificación, es decir, la detección en el genoma de la bacteria a través de la PCR, un fragmento de los locus que participan en la biogénesis de las enzimas para la síntesis de los polisacáridos capsulares, de hecho ya ha sido publicada la secuencia de cebadores que permiten la identificación de los 33 genoserotipos por PCR (Liu y col., 2013; Cai1 y col., 2014).

Las cepas de P. multocida también producen una cápsula que por su composición química ha permitido identificar 5 tipos capsulares (A, B, C, D y E) los cuales están relacionados con la especie animal que afectan, en el caso del cerdo las cepas tipo capsular A producen neumonías fundamentalmente y las del tipo capsular D la RAP. Al igual que S. suis, el tipo capsular de P. multocida se puede detectar por la utilización de antisueros y también mediante la genoserotipificación para lo cual es recomendado el trabajo publicado por Townsend y col. quienes dieron a conocer la secuencia de los cebadores específicos para definir por PCR de qué tipo capsular se trata.

Ensayos de laboratorio aplicados a la epidemiologia de S. suis y P. multocida

Se han utilizado diferentes métodos de laboratorios fenotípicos y moleculares para caracterizar la diversidad de cepas dentro de una especie, pero la falta de reproducibilidad entre los laboratorios ha sido el principal inconveniente (Järvinen y col., 1999). La metodología basada en múltiples locus de secuencias tipo MLST se ha implementado para la vigilancia epidemiológica de las infecciones producidas por diferentes géneros de bacterias que presenta una diversidad poblacional (Aanensen y col., 2005). Se trata de una herramienta de comunicación global, de gran reproducibilidad que se basa en la amplificación y secuenciación de un conjunto de fragmentos de genes con función metabólica a partir de varias cepas. Los productos de PCR son secuenciados y se depositan en bases de datos para permitir su comparación a nivel mundial y mediante programas computacionales se agrupan en varios complejos de secuencias tipos (ST) (Aanensen y col., 2005).

Fue publicado por primera vez un modelo de MLST para S. suis por King y col. en el 2002. Las cepas más virulentas que producen brotes en Europa y Asia pertenecen a los complejos ST1 and ST16 mientras en América del Norte las cepas menos virulentas pertenecen a los complejos ST25 y ST28 (Atanassov y col., 2015). Un esquema MLST fue desarrollado para P. multocida pero la mayoría de los aislados que han sido procesados son de origen aviar, muchas de las ST son específicas de los hospedadores en los que fueron encontrados. La ST13 fue una excepción pues en la misma agrupa asilados de origen bovino y porcino (Subaaharan y col., 2010).

Control de la infección por S. suis y P. multocida

Para el control de estas infecciones se utilizan varias alternativas: la aplicación de antibióticos, vacunas y estrategias de manejo combinadas con un adecuado sistema de bioseguridad. Se han investigado más las estrategias de vacunación para el control de la infección por S. suis, debido a que presenta una mayor heterogeneidad. Las opciones más utilizadas han sido las cepas inactivadas, los polisacáridos conjugados, cepas recombinantes, cepas vivas mutadas y vacunas de subunidad (Fittipaldi y col., 2007; Baums y col., 2010). Las estrategias de vacunación tienen el reto de insertarse en un entorno donde prevalecen la interferencia por anticuerpos pasivos y la presencia de otras infecciones concurrentes (Halbur y col., 2001).

Para tratar las infecciones por S. suis en animales y humanos los antibióticos que más se han usado son las aminopenicilinas y las quinolononas. La PCR también puede utilizarse para la detección con rapidez en el genoma de la bacteria de genes que están relacionados con la resistencia a determinados antibióticos. En los años más recientes varios grupos de trabajo han reportado el incremento en el número de cepas resistentes fundamentalmente a quinolonas (Escudero y col., 2007; Zhang y col., 2015). Un estudio realizado en nuestro laboratorio agrupó colecciones de cepas de P. multocida y S. suis de dos periodos diferentes y encontró un incremento notable en los porcentajes de resistencia a fármacos de uso en porcicultura y salud pública (figuras 1 y 2) ( Baez y col., 2012; Espinosa y col., 2012).

Una expresión asociada a la resistencia es la habilidad que presentan las bacterias para adherirse a superficies bióticas y abióticas y producir biopelículas garantizando su persistencia, incluso en el ambiente. La formación de biopelículas en superficies abióticas y en tejidos se ha demostrado para S. suis (Bonifait y col., 2008), y para P. multocida solamente en superficies abióticas (Ramachandranpillai y col., 2013). Los ensayos de adherencia en placas de S. suis han demostrado que las cepas no tipificables, que no expresan material capsular en su superficie, muestran un mayor hidrofobicidad que favorece la adherencia celular a estas superficies y esto podría favorecer su persistencia en explotaciones porcinas, por lo que aun cuando estas cepas no pertenecen a ningún serotipo conocido deben tenerse en consideración al elaborar estrategias de control (Willenborg y col., 2014).

Conclusiones

Las recomendaciones para el control de estas infecciones se basan en una selección cuidadosa y un apropiado uso de los antimicrobianos, para evitar la emergencia de cepas resistentes que puedan transferir marcadores genéticos entre las cepas. Estas recomendaciones se deben apoyar en un adecuado respaldo en el laboratorio dirigido a la detección de los microorganismos para una correcta interpretación de los resultados teniendo en consideración aspectos específicos de la unidad de crianza. Es preciso que los usuarios conozcan qué patógenos pueden estar presentes en sus granjas, teniendo en cuenta que cada unidad representa un sistema biológico diferente y no es apropiado extrapolar los resultados.

Bibliografía

Aanensen DM, Spratt BG. 2005. The multilocus sequence typing network: mlst.net. Nucleic Acids Res. 33:W728–W733.
Arends JP, Zanen HC. Meningitis caused by Streptococcus suis in humans. Rev InfectDis 1988; 10: 131–137.
Baez Michel, Ivette Espinosa, J. Vichi, Siomara Martínez. 2012.Estudio de la sensibilidad in vitro frente a diferentes antimicrobianos en cepas de S. suis asociados a neumonía porcina Rev. Salud Anim. vol. 34 no. 1: 57-62.
Barenfanger J, Drake C, Kacich G.1999. Clinical and financial benefits of rapid bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol ;37:1415-1418.
Baums Christoph Georg, Christian Bru¨ggemann, Christoph Kock, Andreas Beineke,Karl-Heinz Waldmann and Peter Valentin-Weigand.2010. Immunogenicity of an Autogenous Streptococcus suis Bacterin in Preparturient Sows and Their Piglets in Relation to Protection after Weaning Clinical and vaccine immunology.1589–1597.
Bethe Astrid, Lothar H. Wieler, Hans-J. Selbitz, Christa Ewers. 2009. Genetic diversity of porcine Pasteurella multocida strains from the respiratory tract of healthy and diseased swine Veterinary Microbiology 139 97–105.
Boot R., M. Van den Brink , P. Handgraaf & R. Timmermans. 2004. The use of the API 20 NE bacteria classification procedure to identify Pasteurellaceae strains in rodents and rabbits. Scand. J. Lab. Anim. Sci. No. 3. Vol. 31.
Berthelot-hérault Florence, Hervé MORVAN, Anne-Marie Kéribin, Marcelo Gottschalk, Marylène Kobisch 2000. Production of Muraminidase-Released Protein (MRP),Extracellular Factor (EF) and Suilysin by field isolates ofStreptococcus suis capsular types 2, 1/2, 9, 7 and 3 isolated from swine in France Vet. Res. 31. 473–479.
Bonifait Laetitia, Louis Grignon, and Daniel Grenier. 2008. Fibrinogen Induces Biofilm Formation by Streptococcus suis and Enhances Its Antibiotic Resistance Applied and environmental microbiology. 4969–4972.
Cai1 H. Y., J. L. Caswell2, and J. F. Prescott. 2014. Nonculture Molecular Techniques for Diagnosis of Bacterial Disease in Animals:A Diagnostic Laboratory Perspective Veterinary Pathology.Vol. 51(2) 341-350.
Dziva Francis, Amandus P. Muhairwa, Magne Bisgaard, Henrik Christensen 2008. Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida Veterinary Microbiology 128. 1–22.
Escudero Jose Antonio, Alvaro San Millan, Ana Catalan, Adela G. de la Campa,Estefania Rivero, Gema Lopez, Lucas Dominguez, Miguel Angel Moreno, and Bruno Gonzalez-Zorn. 2007. First Characterization of Fluoroquinolone Resistance inStreptococcus suis Antimicrobial agents and chemotherapy. 777–782.
Espinosa Ivette, M. Báez, J. Vichi, Siomara Martínez 2012.Antimicrobial Resistance and genes associated to the host-microbe interaction of Pasteurella multocida isolates from swine in Western Cuba Rev. Salud Anim. Vol. 34 No. 3.
Feng Youjun, Huimin Zhang, Zuowei Wu, Shihua Wang, Min Cao, Dan Hu, and Changjun Wang. 2014.Streptococcus suis infection An emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases? Virulence 5:4, 477–497.
Fittipaldi Nahuel, Jos’ee Harel, Benoit D’Amoursa, Sonia Lacouture, Maryl`ene Kobisch , Marcelo Gottschalk. 2007. Potential use of an unencapsulated and aromatic amino acid-auxotrophic Streptococcus suis mutant as a live attenuated vaccine in swine Vaccine 25. 3524–3535.
Goyette-Desjardins Guillaume, Jean-Philippe Auger1, Jianguo Xu, Mariela Segura and Marcelo GottschalkStreptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent—an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing 2014. Emerging Microbes and Infections. 3.
Gottschalk, M., Higgins R., Boudreau M. 1993 Use of polyvalent coagglutination reagents for serotyping ofStreptococcus suis. J. Clin. Microbiol 31, 2192–2194.
Halbur Patrick G. Development of Improved Streptococcus suis Vaccines for Control of PRRSV and S. suisCoinfection – NPB# 00-092 research report swine health 2001.
Harper Michael Frank St. Marina,Henrietta Parnas,Marietta John, Jacek Stupak, Evgeny Vinogradov,Ben Adler, John D. Boyce and Andrew D. Cox. 2009.Structural and Genetic Basis for the Serological Differentiation ofPasteurella multocida Heddleston Serotypes 2 and 5 Structural and Genetic Basis for the Serological Differentiation of Pasteurella multocida Heddleston Serotypes 2 and 5 Journal of bacteriology. 6950–6959.
Higgins R, Gottschalk M. Streptococcocal diseases. In: Straw BE,D’Allaire S, Mengeling WL, 2005. Taylor DJ, editors. Diseases of swine.Ames, Iowa: Iowa State University Press. p. 769–83.
Hill JE, Gottschalk M, Brousseau R, Harel J, Hemmingsen SM et al.2005 Biochemical analysis, cpn60 and 16S rDNA sequence dataindicate that Streptococcus suis serotypes 32 and 34, isolated from pigs, are Streptococcusorisratti. Vet Microbiol 107: 63-69.
Järvinen Anna-Kaarina, Sanna Laakso, Pasi Piiparinen, Anne Aittakorpi, Merja Lindfors, Laura Huopaniemi, Heli Piiparinen and Minna Mäki.2009. Rapid identification of bacterial pathogens using a PCR- and microarray-based assay BMC Microbiology. 9:161.
Kerremans JJ, Verboom P, Stijnen T, Hakkaart-van Roijen L, Goessens W, Verbrugh HA, Vos MC: 2008.Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing reduce antibiotic use and accelerate pathogen-directed antibiotic use. J Antimicrob Chemother .61:428-435.
Kim D, Han K, Oh Y, Kim CH, Kang I.2010. Distribution of capsular serotypes and virulence markers ofStreptococcus suis isolated from pigs with polyserositis in Korea. Can J Vet Res 74:314-316.
King Samantha J. James A. Leigh,Peter J. Heath, Inmaculada Luque,4 Carmen Tarradas,Christopher G. Dowson and Adrian M. Whatmore1 2002. Development of a Multilocus Sequence Typing Scheme for the Pig PathogenStreptococcus suis: Identification of Virulent Clones and Potential Capsular Serotype Exchange Journal of clinical microbiology. p. 3671–3680.
Le HTT, Nishibori T, Nishitani Y, Nomoto R, Osawa R. 2013.Reappraisal of the taxonomy of Streptococcus suisserotypes 20, 22, 26, and based on ADN–ADN homology and sodA and recN phylogenies. Vet. Microbiol. 162(2–4), 842–849.
Liu Zhijie, Han Zheng, Marcelo Gottschalk, Xuemei Bai, Ruiting Lan, Shaobo Ji, Haican Liu,Jianguo Xu. 2013. Development of Multiplex PCR Assays for the Identification of the 33 Serotypes of Streptococcus suis PLOS ONE | www.plosone.org 1 August 2013 | Volume 8 | Issue 8 | e72070.
Marois C., M.LeDevendec, M.Gottschalk. 2007. Detection and molecular typing of 262 Streptococcus suis in tonsils from live pigs in France. Can J Vet Res. 71(1):14-22.
Messier S, Lacouture S, Gottschalk M 2008. Distribution of Streptococcus suis capsular types from 2001 to 2007. Can Vet J 49: 461-462.
Okwumabua Ogi, Michael O’Connor, Eileen Shull. 2013.A polymerase chain reaction (PCR) assay speci￠c forStreptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase FEMS Microbiology Letters 218. 79^84.
Pijoan C. Pneumonic pasteurellosis. In: Straw BE, D’Allaire S,mMengeling WL, 1999. Taylor DJ, eds. Diseases of Swine. Ames, Iowa Iowa State University Press, :511–520.
Ramachandranpillai Rajagopal, Govindapillai Krishnan Nair, Mangattumuruppel Mini1, Leo Joseph, Mapranath Raghavan Saseendranath, Koshy John.2013. Biofilm formation of Pasteurella multocida on bentonite clay Iran. j. microbiol. Vol. 5, No. 2 , 120-125
Rimler, R. B., and K. R. Rhoades. 1989. Pasteurella multocida, p. 37–73. In C. Adlam and J. M. Rutter (ed.),Pasteurella and pasteurellosis. Academic PressLimited, London, United Kingdom.
Schultsz C, Jansen E, Keijzers W, Rothkamp A, Duim B 2012.Differences in the population structure of invasiveStreptococcus suis strains isolated from pigs and from humans in The Netherlands.
Subaaharan S, Blackall LL, Blackall PJ. 2010. Development of a multilocus sequence typing scheme for avian isolates of Pasteurella multocida. Vet. Microbiol. 141:354 –361.
Townsend, K.M., Frost, A.J., Lee, C.W., Papadimitriou, J.M., Dawkins, H.J.S., 1998. Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates. J. Clin. Microbiol. 36, 1096–1100.
Van der Sluijs Koenraad F, Tom van der Poll, Rene Lutter, Nicole P Juff ermans and Marcus J SchultzBench-to-bedside. 2010. Review: Bacterial pneumonia with infl uenza – pathogenesis and clinical implicationsvan der Sluijset al. Critical Care., 14:219.
Vu Thi Lan Huong, Ngo Thi Hoa, Peter Horby, Juliet E. Bryant, Nguyen Van Kinh, Tran Khanh Toan, and Heiman F.L. Wertheim 2014. Raw Pig Blood Consumption and Potential Risk for Streptococcus suis Infection, Vietnam Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 20, No. 11.
Tien le HT, Sugiyama N, Duangsonk K, Tharavichitkul P, Osawa R. 2012.Phenotypic and PCR-based identification of bacterial strains isolated from patients with suspected Streptococcus suis infection in northern Thailand. Jpn J Infect Dis 65: 171–174.
Willenborg Jörg , Daniela Willms, Ralph Bertram, Ralph Goethe and Peter Valentin-Weigand. 2014. Characterization of multi-drug tolerant persister cells in Streptococcus suis BMC Microbiology.14:120.
Wisselink HJ, Smith HE, Stockhofe-Zurwieden N, Peperkamp K, Vecht U.2000. Distribution of capsular types and production of muramidasereleased protein (MRP) and extracellular factor (EF) of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven European countries. Vet Microbiol 74: 237-248.
Zhang Chunping, Zhongqiu Zhang, Li Song, Xuezheng Fan, Fang Wen, Shixin Xu, and Yibao Ning 2015.Antimicrobial Resistance Profile and GenotypicCharacteristics of Streptococcus suis Capsular Type 2 Isolatedfrom Clinical Carrier Sows and Diseased Pigs in China Chunping BioMed Research InternationalVolume 2015, Article ID 284303, 9 pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2015/284303.