Erisipela porcina la enfermedad olvidada

Detección de Erysipelothrix rhusiopathiae asociado a endocarditis y abortos en cerdos de tres granjas porcinas cercanas a Guadalajara, Jalisco.

De Haro-Cruz MJ.1, Gutierrez-Paredes S.1, Guerra-Infante FM.1,2, and Campos Morales E.3 Moreno Gómez E.3  1Departmento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n. Col. Casco de Santo Tomas,  C.P. 11340, Ciudad de México, 2 Laboratorio de Virología del Instituto Nacional de Perinatología, Montes Urales 800 Col. Lomas Virreyes, Ciudad de México. C.P. 11000. 3 Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias-UDG, avenida Juárez 976, col centro Guadalajara, Jalisco, C.P.44100. México
Resumen:

Erysipelothrix rhusiopathiae es el agente causal de la erisipela porcina, enfermedad que ocasiona pérdidas económicas importantes en las explotaciones ganaderas porcinas. En México se desconoce  la presencia de la infección, principalmente porque el cuadro clínico se presenta acompañado por otros patógenos, además el aislamiento es difícil por los requerimientos de la bacteria. En un rancho porcícola de Guadalajara se dieron a conocer casos de endocarditis, disminución en la producción y observación de manchas rojizas en la piel de animales jóvenes y  las hembras de pie de cría, por lo que se buscó la presencia del microorganismo en la explotación. Metodología: Se recolectaron muestras de sangre, corazón,  amígdalas y liquido sinovial de cerdos de 7 meses de edad y de hembras de pie de cría. Las muestras de sangre se sembraron en caldo selectivo para Erysipelothrix, los órganos se sembraron en gelosa sangre, medio de packer modificado y agar soya tripticaseina suplementado con suero de caballo. A partir de líquido sinovial, corazón y amígdalas se logró el aislamiento de 5 cepas Erysipelothrix rhusiopathiae y uno de Pasteurella multocida. Los aislamientos de E. rhusiopathiae fueron confirmados por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Estos hallazgos determinan la presencia de E. rhusiopathiae como causantes de endocarditis en Guadalajara, Jalisco México.
Palabras clave:

Erysipelothrix rhusiopathiae, cepas de campo, endocarditis.
Introducción

Erysipelothrix rhusiopathiae es el agente causal de la erisipela porcina,  de septicemia en aves, además de erisipeloide en humanos (procariotes 2006, vaccine 2010). La erisipela de los cerdos se  ha aislado en Europa, Asia, África, América, Japón, China, Estados Unidos, Australia, Brasil y Chile entre otros.  La enfermedad causada por este microorganismo causa serias pérdidas económicas en la industria ganadera debido a la muerte de los cerdos y a la devaluación de las canales por la artritis (CES 2008).
Los signos clínicos en cerdos pueden ser agudos, subagudos y crónicos. La forma subaguda se caracteriza por lesiones en la piel con forma de diamante que progresan a una forma aguda ocasionando infección septicémica y muerte. La forma crónica sigue de la infección aguda causando daño en las válvulas cardiacas (endocarditis) y articulaciones (artritis) (J Vet 1999)

Erysipelothrix rhusiopathiae se aísla principalmente de tonsilas o de lesiones de endocarditis y/o artritis a partir de cuadros clínicos agudos o crónicos. La prevalencia de la infección en cerdos portadores oscila entre 3 y 98%; sin embargo debido al aumento de las explotaciones cerradas para el ganado porcino y la ausencia de contacto con terreno contaminado, la incidencia de la enfermedad ha disminuido notablemente (ces 2008).
La identificación del microorganismo es difícil ya que las técnicas de cultivo tardan entre 3 a 10 días para hacer la identificación y tipificación del microorganismo, por lo que se han implementado técnicas  moleculares para la identificación a partir de muestras clínicas o cepas aisladas lo que ha disminuido el tiempo en el que se identifica a la bacteria ( J clinical microbiol 1999).
Se desconoce la presencia del microorganismo en México ya que no existen estudios epidemiológicos que determinen su incidencia en el país, principalmente debido a que se encuentra asociado a otros patógenos y su aislamiento es difícil. En este estudio, se determinó la presencia de E. rhusiopathiae en tres granjas de cerdos cercanas a Guadalajara, Jalisco a partir de muestras  de tonsilas, corazón, articulaciones y fetos abortados de 62 a 65 días de gestación. Es por esto que se deben realizar más estudios para determinar la prevalencia de la enfermedad y si puede estar afectando la economía mexicana.
Materiales y métodos
Muestras de elección.
Se obtuvieron muestras de corazón, amígdalas, líquido sinovial y sangre de animales con sospecha de infección con la bacteria. Las muestras de tejido se colocaron en frascos con medio de transporte de Stuart, en tanto que las muestras de sangre se obtuvieron en tubos con heparina para evitar su coagulación. Las muestras se mantuvieron en refrigeración hasta su procesamiento en el laboratorio.
Aislamiento del agente etiológico.
Las muestras de órgano se maceraron y se sembraron en agar sangre, agar soya tripticaseina complementado con 3% de suero de caballo y medio de Packer modificado. Los medios de cultivo fueron incubados a 37° C durante 24-48 h.  Las colonias con una morfología microscópica y colonial compatible a Erysipelothrix sp. fueron resembradas en agar soya tripticaseína con 3% de suero de caballo y agar sangre para su posterior identificación fenotípica.
Identificación fenotípica.
Las cepas sospechosas de E. rhusiopathiae fueron identificadas mediante el API Coryne System ( Soto 1994) utilizando adicionalmente pruebas de movilidad, producción de ácido sulfhídrico y reacción negativa a la catalasa y oxidasa.
Identificación molecular.
Para el diagnóstico molecular, se realizó la extracción de DNA bacteriano por el método descrito por Yamazaki (2). Brevemente, la bacteria se resuspendió en 100 µL  de proteinasa K (0.5 mg/ml) se incubo a 50°C por 30 minutos. Pasado este tiempo se adicionaron 300 µL de 1.5 mM de Tris-HCL pH 8 y se centrifugo a 20000 g por 10 minutos. El sobrenadante se separó y se trató con una mezcla de fenol-cloroformo (1:1), agitándose por 10 minutos, finalmente se centrifugo a 10000 g por 10 minutos, precipitando el DNA con etanol absoluto frío. La pastilla obtenida se resuspendio en 50 µL  de agua inyectable. Los iniciadores para la amplificación del gen 16S de Erysipelothrix sp. fueron MO101 (5´-agatgcccatagaaactggta-3´) y ERS-1R (5´-ctgatccgcgattactagcgattgcg-3´), que amplifican un fragmento de 719 pb (2).
Para genotipificar los aislamientos de  E.  rhusiopathiae, se utilizó la secuenciación del gen spaA que codifica para proteínas de superficie. Los iniciadores utilizados fueron Erko-1F (5´-gtgaaacaccgtattttagta-3´) y  Erko-2R (5’-ttcaagaagttcctgtagttt-3´) las cuales amplifican un fragmento de 432 pb (3).
La secuenciación se realizó por medio de un secuenciador ABI PRISM 310 (PE Biosystems) utilizando el kit BigDye DNA sequencing (PE Biosystems) de acuerdo a las instrucciones del proveedor.
Resultados
En un rancho experimental en Guadalajara, Jalisco se reportaron casos de cerdos con lesiones en las orejas (pabellón auricular lo cual se denomina oreja de chicharrón o acartonada), acumulación de un líquido rojo obscuro con un olor desagradable a putrefacción y que desapareció días después de que se le aplico al cerdo penicilina, fiebre, anorexia, cianosis en las región ventral del cerdo, en dos casos se observaron manchas rojas en la piel simulando un rombo y a la necropsia se observaron en pulmones neumonía, edema en el órgano y endocarditis proliferativa en las válvulas auriculo-ventriculares, esplenomegalia, en articulaciones del carpo y metacarpo; el líquido sinovial de color ámbar e inflamación en la superficie articular (figura 1), a partir de estos animales se tomaron y analizaron 28 muestras  como se muestra en la tabla 1. De las muestras de líquido sinovial y fetal (1/3), amígdalas (5/6)  y corazón (2/11) se aislaron 8 cepas sospechosas de Erysipelothrixsp de las cuales 5 fueron identificadas como E. rhusiopathiae de acuerdo a su perfil bioquímico.
A partir de las cepas aisladas y caracterizadas bioquímicamente se realizó la extracción de DNA, además utilizando una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada  se amplifico el gen 16S especifico de género Erysipelothrix y el gen spaA especifico de la especie rhusiopathiae. Las 5 muestras identificadas por su perfil bioquímico amplificaron los genes 16S y spaA (figura 2), se realizó la secuenciación de dos muestras para ambos genes encontrándose que corresponden a Erysipelothrix rhusiopathiae (figura 3)
Discusión
La bacteria que ocasiona el cuadro clínico de erisipela en apariencia es una bacteria sin importancia en la clínica de porcinos ya que por su patogenicidad pasa desapercibida en la mayoría de los casos, sin embargo  es de importancia económica ya que su efecto patológico causa retraso en el desarrollo de los cerdos, problemas reproductivos en sementales como orquitis y ocasionando necrosis de los tejidos que conforman el testículo, y en cerdas reproductoras causa lesiones y necrosis del ovario, produce abortos, además de ser una bacteria que afecta a la salud pública ya que puede infectar a los trabajadores. Las pérdidas económicas son cuantiosas por los abortos y al retraso en la engorda del cerdo de aproximadamente 28 días (6).
En tres explotaciones porcícolas de ciclo completo en Guadalajara-Jalisco, México, se detectaron animales con problemas de artritis, endocarditis y placas eritematosas en la piel de animales de 5 semanas de edad, además de abortos en cerdas gestantes de 62 a 68 días de preñez, a partir de estos animales se determinó  la presencia de E. rhusiopathiae en muestras de sangre, amígdalas, liquido sinovial y válvulas cardiacas. El diagnóstico de la enfermedad se realiza principalmente  con el aislamiento en medios selectivos y con la identificación del microorganismo mediante pruebas bioquímicas convencionales ( Yamazaki 2006), en este estudio se obtuvieron 8 aislamientos a partir de muestras de corazón, líquido sinovial y amígdalas de los cuales cinco fueron identificados como E. rhusiopathiae utilizando el sistema APY Coryne System.
El aislamiento y la identificación de E. rhusiopathiae tiene muchas desventajas ya que es una bacteria que requiere medios de cultivo especiales suplementados con suero, sangre o antibióticos que impidan el crecimiento de biota acompañante, el crecimiento es lento y la utilización de pruebas bioquímicas convencionales en muchos de los casos no permite una correcta identificación entre E. rhusiopathiae y E. tonsillarum, por lo que se utilizan técnicas de biología molecular para la identificación rápida y efectiva de este microorganismo (Wang 2010).
Se han establecido diversas metodologías para la identificación molecular de E. rhusiopathiae a partir de tejidos y de aislados clínicos, en este estudio se utilizó una técnica de PCR anidada donde se amplifica un fragmento de 719 pb que corresponde al gen 16s para la identificación de género y un fragmento de 432 pb correspondiente al gen spaA  para la identificación de especie (Yamazaki 2006, To 2012). Los resultados muestran que cinco de los ocho aislamientos amplificaron los fragmentos de 719 pb y 432 respectivamente, a partir de esto se secuencio el gen spa A demostrándose que los 5 aislamientos corresponden a E. rhusiopathiae.
Los resultados de este trabajo demuestran la presencia de E. rhusiopathiae en tres granjas cercanas a Guadalajara ocasionando problemas de endocarditis y falla reproductiva.

IMAGENES DE LESIONES ENCONTRADAS EN CERDOS AFECTADOS POR ERYSIPELA RUSHIOPATHIAE

ARTICULACIONES DEL CARPO AFECTADAS POR ERISIPELA

  

SEMENTAL CON ORQUITIS UNILATERAL

SEMENTAL AFECTADO POR ERISIPELA: ESPERMATOZOIDES CON CABEZAS DEFORMES

ABORTO DE 62 DÍAS DE GESTACIÓN.

ABORTO DE 68 DÍAS DE GESTACIÓN.

BIBLIOGRAFIA:
1.  Stackebrandt E.,  Reboli A.C. and  Farrar W.E. The genus Erysipelothrix. (2006) Prokaryotes. 4:492–510. DOI: 10.1007/0-387-30744-3_13
2. Ingebritsona A. L., Rothb J.A. and Hauerc P.J. Erysipelothrix rhusiopathiae: Association of Spa-type with serotype and role in protective immunity. (2010) Vaccine. 20: 2490–2496.
3. Takahashi T., Sunama P., Satra J., Cholsindhu N., Kongthon S., Jitnupong w., Yamamoto K., Kijima M and Furuuchi S. Serotyping and Pathogenicity of Erysipelothrix Strains Isolated from Tonsils of Slaughter Pigs in Thailand. (1999).  J. Vet. Med. Sci. 61(9): 1007–1011
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DNAs prepared from bacterial strains and animal tissues. (1999). J. Clin. Microbiol. 37 (12): 4093-4098.
6. Soto A, Zapardiel J and  Soriano F. Evaluation of API Coryne system for identifying coryneform bacteria. (1994) J. Clin Pathol 1994; 47:756-759
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